Concentration en protéines d'une solution

Pour estimer la quantité de protéines (totales) que contient une solution plusieurs méthodes existent. Le choix entre ces différentes méthodes s'effectue en fonction de plusieurs critères caractéristiques :

  • sensibilité ,
  • spécificité (ou généricité)
  • facilité de mise en œuvre,
  • non destructif (pour les protéines).

La méthode que nous vous proposons est une des plus sensibles, assez générale, bien que plus sensible à certaines protéine comme l'albumine mais surtout facile à mettre en œuvre. C'est la méthode de Bradford. Nous pouvons citer comme autres possibilités :

  • Méthode de Folin-Lowry :
    moins sensible que la méthode de bradford , stable, mais présente de nombreusew réctions croisées lorsque on l'utilise pour des solution complexes, les proteines ne sont plus intègres après le test
  • Méthode de Cristian-Warburg :
    Plus difficile à mettre en œuvre necessite un spectrophotomètre dans les UV, interférences lorsque qu'il y a présence d'autres corps aromatiques, mais ne détruit pas les proteines après le test.

Méthode de Bradford

Réactif et matériel

Protocole

Mise en oeuvre

Méthode de Bradford

Le bleu de Commassie G250 se complèxe avec les chaines latérales des acides aminés basiques (lysine, arginine, histidine) et sur les fonctions amines libres de la chaine polypeptidique en formant un complèxe chromogène présentant un maximum d'absorption à 595nm. Il y a donc une corrélation entre la quantité de colorant formé dans une solution et la concentration en protéine.

    Gamme étalon
    Cette méthode est une méthode relative c'est à dire que l'on réalise d'abord une gamme (ou étalon) à partir de quelques tubes  de concentrations connues. On utilise généralement de la BSA (Bovine Serum Albumin) comme proteine standard. Cette gamme permet d'établir une courbe étalon de la concentration en fonction de l'absorbance mesurée. Les concentrations utilisées pour cette gamme doivent être comprisent dans la zone linéaire du colorant utilisé : ici entre 0.1 à 1.4mg/mL Une fois les points correspondant à la gamme positionnés sur le plan on les relie par une droite approximant la linéarité de la courbe théorique (courbe en rouge sur la figure 1).

     

    Figure 1.- Courbe étalon représentant la variation de la concentration en BSA en fonction de l'absorbance

     

    Mesure des échantillons inconnus
    Pour évaluer la concentration d'un echantillon il sufit alors d'utiliser le même volume que celui utilisé pour les points de la gamme (volume total et volume du réactif), d'en lire l'absorption à 595nm au photomètre puis d'en reporter la mesure sur la courbe étalon qui nous donnera la concentration correspondante. Illustrons le sur un exemple ou l'on suppose que l'absobance lue à 595nm est de 1.25 nous reportons cette valeur sur l'axe des x de l'étalon et nous trouvons environ 0.75mg/ml pour le concentration en proteine comme indiqué en vert sur la figure 2.

    Figure 2.- Utilisation de l'étalon pour trouver la concentration en proteine d'un échantillon présentatnt une absorbance de 1.25 (nous obtenons une concentration de 0.75mg/mL)

 Sommaire
  Précédent

 Sommaire
  Précédent

Réactif de Bradford

  • Bleau de Coomassie G250                        100mg
  • Ethanol à 95%                                            50mL
  • Acide phosphorique (H3PO4) à 85%        100mL
  • dH2O                                                        QSP 1L
    • A concerver à +4°C à l'abrit de la lumière

Autre réactif utilisé

  • Solution mère (stock) de sérumalbumine (BSA) à 2g/L (2mg/mL)
    ou obtenue à partir de solubilisation de BSA lyophisisée dissoute dans de l'eau distilée

Matériel utilisé

  • Spectromètre à 595nm (comme celui proposé en réalisation en section électronique)
  • Tubes à essais 5mL (type hémolyse) (x6)
  • Cuves spectro visible 3.5mL (x6)
  • Micropipettes 200µL et 5m + cones

Protocole expérimental

  • Préparation des dilutions de BSA

    Volume total = 2mL par dilution

    •  

    T025

    T05

    T1

    T14

    BSA stock (2mg/ml)

    0.25mL

    0.5mL

    1mL

    1.4mL

    dH2O

    1.75mL

    1.5mL

    1mL

    0.6mL

    [BSA] (mg/mL)

    0.25

    0.5

    1

    1.4

 

  • Préparation de la gamme étalon

    Nous utiliserons 5 points pour tracer la droite pour un volume réactionnel total de 3.1ml par échantillon.

    • N° Tube

    volume de BSA (mL)

    [BSA] des dilutions (mg/mL)

    Réactif de Brad. (mL)

    1 (Blanc)

    0.1

    0

    3

    2

    0.1

    0.25

    3

    3

    0.1

    0.5

    3

    4

    0.1

    1

    3

    5

    0.1

    1.4

    3

 

  •  Tracé de la gamme étalon
    Régler le photomètre sur 594nm
    La lecture de l'absorbance de chaque tube se fera contre le Blanc (tube ne contenant pas de protéine), il faut donc d'abord positionner le zero avec le tube n°1
    Pour chaque tube de la gamme reporter dans un tableau l'absorbance indiquée par le photomètre :
     

    • N° Tube

    Abs à 594nm

    2

     

    3

     

    4

     

    5

     

    Tracer la courbe étalon [Proteine]=f(Abs)
    Tracer la droite d'approximation linéaire (passant par l'origine) qui approche au mieux les points de la gamme

      En théorie suivant la règle des moindres carrés cette droite de la forme y=ax est déterminée par le seul coefficient a qui est donnée par l'équation :  

  • Mesure d'un échantillon inconnu
    Pour déterminer la concentration d'un echantillon inconnu : préparer une cuve avec 3mL de réactif de bradford ajouter 0.1mL de l'echantillon puis lire son absorbance et la reporter sur la courbe d'approximation comme sur la figure 2 qui permet de retrouver sa concentration sur l'axe des ordonnées.

    Une illustration de la mise en œuvre de ce protocole est proposé en section illustration et utilise le photomètre que vous pouvez réaliser vous même décrit en section électronique.
    L'utilisation de ce photomètre est rendue encore plus facile car il intère une fonction automatique pour la méthode de Bradford.

 Sommaire
  Précédent

 Sommaire
  Précédent